ОСОБЕННОСТИ РАСПРЕДЕЛЕНИЯ ФУЛЛЕРЕНОВЫХ НАНОЧАСТИЦ В ОРГАНИЗМЕ ПРИ ПРОВЕДЕНИИ ДОКЛИНИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ

ОСОБЕННОСТИ РАСПРЕДЕЛЕНИЯ ФУЛЛЕРЕНОВЫХ НАНОЧАСТИЦ В ОРГАНИЗМЕ 

Аляутдин Р.Н., Романов Б.К., Меркулов В.А.

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Министерства здравоохранения Российской Федерации, 127051, Москва, Россия


Резюме:

C60 фуллерен, состоящий из 60 атомов углерода, представляет собой замкнутую структуру, включающую 12 пентагональных и 20 гексагональных граней. Диаметр молекулы составляет 0,71 нм. Фуллерены являются третьим, после графита и алмаза, состоянием углерода. Фуллереновые наночастицы плохо всасываются из ЖКТ, и это затрудняет исследование закономерностей их распределения в организме. Однако, при системном введении анализ распределения фуллеренов указывает на типичное для наночастиц с немодифицированной поверхностью распределение по органам: накопление в органах, содержащих клетки ретикуло-эндотелиальной системы: печени, селезенке и легких. Специфической особенностью фуллеренов является их медленное выведение из организма, что в первую очередь обусловлено практически отсутствием метаболизма этих структур в организме.


C60 фуллерен (C60), состоящий из 60 атомов углерода, представляет собой замкнутую структуру, состоящую из 12 пентагональных и 20 гексагональных граней и по внешнему виду напоминает футбольный мяч (рис. 1). Диаметр молекулы составляет 0,71 нм. Фуллерены являются третьим, после графита и алмаза, состоянием углерода. Впервые фуллерен С60 был получен R.F. Curl, R.E. Smalley и H.W. Kroto в © КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2015 УДК 615.917:54.022 23 1985 г. при лазерной спектроскопии углерода [1]. В 1996 г. эта группа исследователей получила Нобелевскую премию за открытие нового класса соединений. 

Эта группа соединений получила свое название по имени архитектора R.B. Fuller, так как спроектированные им здания по конструкции и форме предвосхитили фуллерены (рис. 2).

Позже были получены фуллерены с большим числом атомов, например фуллерены С70 эллипсоидной формы, нанотрубки, фуллерены с меньшим числом атомов углерода, С28 и С36 [2].

Будучи пионерским в ряду фуллеренов, соединение С60 исследовано наиболее подробно. Фуллерен С60 представляет собой темно-коричневый порошок, нерастворимый в воде и полярных растворителях, но растворимый в толуоле, дихлорбензоле и других органических растворители, что существенно затрудняет исследование биологических свойств С60 [3].

Немодифицированный С60 может быть помещен в водный раствор путем выпаривания органического растворителя или при очень длительном перемешивании в гидрофильной среде.

С целью повышения растворимости в воде были использованы некоторые нанотехнологические методы, такие как добавление сурфактантов [4] и включение в водорастворимые супрамолекулярные структуры, такие как γ-циклодекстрин [5].

Кроме того, для улучшения растворимости использовались липосомы [6].

Вместе с тем, установлено, что модификация структуры фуллеренов за счет гидроксилирования молекулы (С60(ОН)n), а также присоединения различных радикалов на поверхности сферы способно в значительной степени влиять на физикохимические свойства С60, а также на его транспорт, распределение и метаболизм в организме.

Ковалентное включение радикалов (-ОН, NH2 , -СООН) в фуллереновую структуру приводит к функционализации молекулы, что позволяет установить связи с молекулами воды за счет гидрофильных добавок [7].

Такие соединения проявляют большую гидрофильность, чем исходный С60, что делает их более привлекательным кандидатами для применения в биологии и медицине.

Более того, функционализация фуллеренового ядра снижает способность к образованию синглетного кислорода и увеличивает способность поглощения реактивных соединений кислорода, что позволяет сделать вывод о меньшей токсичности функционализированных фуллеренов по сравнению с исходным соединением [8, 9].

Для оценки всасывания, распределения и выведения фуллеренов наиболее целесообразно использовать радиоактивные молекулы исследуемых веществ [10].

В случае с фуллереном С60 включение радиоактивной метки 14С в ядро возможно теоретически, однако, может привести к радиоактивной контаминации в процессе синтеза и требует значительного количества радиоактивного материала.

В связи с этим при исследовании функционализированных производных фуллерена наиболее рациональным путем является включение радиоактивной метки в радикал, который затем включается в фуллерен.

Всасывание и распределение фуллеренов при введении внутрь. Фуллерены при введении внутрь, независимо от их структуры, плохо всасываются из ЖКТ. При использовании меченых по 14С производных было показано, что препарат во внутренних органах обнаруживался в виде следов и в основном выводился с фекалиями.

Так, Yamago S казано, что гидрофильное триметиленметановое производное фуллерена практически не всасывалось из КТ, а в крови и печени животных были обнаружены лишь его следы. Через 1 час следы радиоактивности были отмечены в моче. В основном фуллерен выводился с калом, в период 30-36 часов этим путем было выведено 96% полученной внутрь радиоактивной метки, а в течение 48 ч введенный меченый по 14С фуллерен был выведен полностью [11].

Не исключено, что именно низкая всасываемость является причиной невысокой токсичности фуллеренов при введении внутрь.

При однократном введении внутрь в высокой дозе 2000 мг/кг С60, растворенного в сурфактанте (полисорбат 80), не было отмечено признаков токсического действия данного соединения, а при аутопсии не обнаружено изменений внутренних органов [12].

Однократное введение полиалкилсульфонированного С60 в дозе 2500 мг/кг не вызывало гибель подопытных животных [13].

Гистологические исследования показали, что фуллерены не оказывают влияния на слизистую кишечника [14].

Наряду с этим, по данным Chen H. и соавт. (1998) чистый С60 в значительно более низкой дозе (0,64 мг/кг) при введении внутрь в физиологичеком растворе или в кукурузном масле значительно усиливал оксидативное повреждение ДНК в печени и легких [15]. 

Использование парентеральных способов введения позволило установить основные закономерности распределения фуллеренов в организме, а также особенностей выведения этих соединений.

Внутрибрюшинное введение. В опытах на мышах при оценке острой токсичности водорастворимый фуллерен с триметиленметановым радикалом однократно вводили в дозе 200-500 мг/кг в 0,2% растворе полисорбата 80 в физиологическом растворе, содержащем диметилсульфоксид.

У мышей, согласно терминологии авторов, развивались признаки дискомфорта, проявлявшиеся в потягивании и изгибах туловища [11], что следует расценить как корчи, признак раздражения брюшины.

Однако, сложный состав использованной наносуспензии не позволяет однозначно указать на раздражающее действие фуллеренов.

Наряду с этим введение максимальной дозы 500 мг/кг препарата вызывало у животных снижение веса на 5-10%.

Тем не менее, интегрируя полученные результаты, авторы делают вывод о низкой токсичности функционализированных фуллеренов [11].

В экспериментах Gharbi N. И соавт. (2005) было показано, что при внутрибрюшинном введении в дозе 500 мг/кг растворенный в полисорбате 60 фуллерен С60 накапливался преимущественно в печени.

При микроскопическом исследовании оказалось, что накопление происходит в основном в купферовских клетках, реже в гепатоцитах или звездчатых клетках печени.

Структура паренхимы была нормальной без признаков воспаления или фиброза, при этом уровень аланин аминотрансферазы в плазме крови оставался без изменений.

Водная суспензия С60 повышала устойчивость печени к действию четыреххлористого углерода [16,17]. При введении меченого по 125I фуллерена в дозе 0,25 мг/ кг в день Zogovic и соавт. (2009) отметили при внутрибрюшинном введении максимальное накопление наночастиц в печени. В меньшей степени фуллерен накапливался в селезенке, легких, сердце и почках [18]. При этом животные нормально набирали вес и в течение 2 недель у них отсутствовали симптомы интоксикации.

В опытах in vitro авторы статьи обнаружили цитотоксическое действие фуллерена на клетки меланомы. Однако, при системном (внутрибрюшинном) введении фуллерен ускорял рост перевиваемой меланомы.

Авторы пришли к заключению, что фуллерен С60 снижает противоопухолевую иммунную защиту.

Сведения о распределении и накоплении фуллеренов при внутрибрюшинном введении неоднозначны.

Так, в исследовании Chien C.T авт. (2001) микроскопическое исследование почек выявило диффузный некроз канальцевого эпителия коры, в основном за счет перегрузки клеток фаголизосомами.

Загруженные фуллеренами макрофаги отмечены также в печени, тимусе и селезенке.

При однократном внутрибрюшинном введении LD50 водорастворимого полиалкилсульфонированного С60 составила 600 мг/кг. [18].

Однако, в другом исследовании, проведенном позже, авторы показали протективное действие фуллерена на клетки эпителия почечных канальцев от оксидативного стресса [18].

В опытах на мышах LD50 полигидроксилированного С60, однократно введенного внутрибрюшинно, составила 1200 мг/кг [19].

В дозе 100 мг/кг гидроксилированный С60 фуллеренол не оказывал влияния на пареметры картины периферической крови, но снижал антиоксидативную устойчивость эритроцитов к соответствующему стрессу, вызванному доксорубицином [20].

Снижение дозы фуллерола до 50 мг/ кг приводило к полной потере любой токсичности и способствало защите от оксидативного стресса в сердце, печени и почках при введении доксорубицина [21].

Внутривенное введение. Этот путь введения позволяет с большей точностью оценить распределение фуллереновых наночастиц в организме.

В экспериментах Chen H. И соавт. (1998) при этом пути введения меченого по 14С фуллерена в первую очередь обращает на себя внимание медленное выведение наночастиц из организма.

Через 160 ч только 5,4% общей дозы было выведено с калом, остальная часть оставалась в теле животных. Выведение с мочой было незначительным. Задержка фуллерена в организме объясняется авторами его высокой липофильностью.

Коэффициент распределения октанол/вода составляет 4,5 и эквивалентен производным фенантрена и 1,2- дифенилэтана. Через1 час после в/в введения в крови содержалось лишь 1,5% от введенной дозы препарата, а через 6 ч – 0,5%. В печени через 1 ч после введения накопилось 73% фуллерена, максимального значения этот параметр достиг через 6-16 ч и составил 91%. Через 30 ч в печени сохранилось около 80% радиоактивной метки, но через 160 ч осталось лишь 1,6%. Через 30 ч наивысшая концентрация радиоактивной метки (2-3%) установлена в селезенке и почках.

Авторы считают, что фуллерены в силу высокой липофильности проникают в мозг. Однако, уровень радиоактивности в тканях мозга невысок, возможно, что это радиоактивность наночастиц, находящихся в капиллярах головного мозга [21].

Сходные результаты были получены при внутривенном введении раствора 14С меченного фуллерена С60 в поливинилпирролидоне (ПВП) самкам мышей и крыс.

Оказалось, что при этом пути введения наночастицы в основном накапливаются в печени, легких и селезенке.

Наблюдение в течение 30 дней показало, что фуллереновын наночастицы медленно выводятся из организма, не более 2% в сутки.

Радиоактивность в плазме крови регистрировалась на 30 сутки после введения [24].

После внутривенного введения 14С фуллерена в растворе ПВП радиоактивность была отмечена в тканях плаценты, плода, в молоке крыс [25].

Неравномерное накопление в тканях организма внутривенно водимых фуллеренов отмечено другими авторами.

Так, Nickolic и соавт. (2009) на быстрое распределение в организме меченого по 125I плением печени и селезенке [26].

Феномен накопления фуллеренов в печени позволил Li Z. и соавт исследовать эти наночастицы как потенциальное средство для лечения опухолей печени [25].

Заключение

На основании представленных данных можно сделать вывод, что фуллереновые наночастицы плохо всасываются из КТ, и это затрудняет исследование закономерностей их распределения в организме.

Однако, при системном введении анализ распределения наночастиц указывает на типичное для наночастиц с немодифицированной поверхностью распределение по органам: накопление в органах, содержащих клетки ретикуло-эндотелиальной системы: печени, селезенке и легких [26, 27].

Специфической особенностью фуллеренов является их медленное выведение из организма, что в первую очередь обусловлено практически отсутствием метаболизма этих структур.

При доклинической оценке безопасности препаратов, содержащих фуллереновые наночастицы, необходимо принимать во внимание значительные изменения физико-химических свойств при функционализации молекул, что в конечном итоге приводит к изменению фармакокинетических параметров и невозможности экстраполяции результатов оценки безопасности одних фуллеренов на структурно различные аналоги.

Наконец, сравнение результатов экспериментов, полученных на различных видах грызунов, позволяет предположить значительные межвидовые различия в распределении и выведении фуллереновых наночастиц.


ЛИТЕРАТУРА:

1. Kroto HW, Heath JR, O’Brien SC, Curl RF, Smalley RE. C60: buckminsterfullerene. Nature 1985; 318:162–3

2. Piskoti C, Yarger J, Zettl A (1998) C36, a new carbon solid. Nature 1998; 393:771–4.

3. Torres VM, Posa M, Srdjenovic B, Simplı´cio AL. Solubilization of fullerene C60 in micellar solutions of different solubilizers. Colloids Surf B Biointerfaces 2011; 82:46–53.

4. Deguchi S, Alargova RG, Tsujii K . Stable dispersions of fullerenes, C-60 and C-70, in water. Preparation and characterization. Langmuir 2001; 17:6013–17.

5. Makha M, Purich A, Raston CL et al. Structural diversity of host-guest and intercalationcomplexes of fullerene C 60 . Eur J InorgChem 2006; 37:507–15.

6. Husebo LO, Sitharaman B, Furukawa T et al. Fullerenols revisited as stable radical anions. J Am Chem Soc. 2004 126:12055–64.

7. Da Ros T, Prato M. Medicin al chemistry with fullerenes and fullerene derivatives. Chem Comm 1999; 8:663–9.

8. Bensasson RV, Berberan-Santos MN, Brettreich et al. Triplet state properties of malonic acid C60 derivatives C60[C(COOR)2]n; R = H, Et; n = 1–6. Phys Chem Chem Phys 2001; 3:4679–4683.

9. Markovic Z, Trajkovic V. Biomedical potential of the reactive oxygen species generation and quenching by fullerenes (C60). Biomaterials 2008; 29:3561–73.

10. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств.Под редакцией А.Н. Миронова. М.: Грифи К. 2012.

11. Yamago S, Tokuyama H, Nakamura E, Kikuchi K et al. In vivo biological behavior of a watermiscible fullerene: 14C labeling, absorption, distribution, excretion and acute toxicity. Chem Biol 1995; 2:385–389.

12. Mori T, Takada H, Ito S, Matsubayashi K, Miwa N, Sawaguchi T. Preclinical studies on safety of fullerene upon acute oral administration and evaluation for no mutagenesis. Toxicology 2006; 225:48–54.

13. Chen HH, Yu C, Ueng TH, Chen S, Chen BJ. Acute and subacute toxicity study of water soluble polyalkylsulfon ated C60 in rats. Toxicol Pathol 1998; 26:143–151.

14. Yamashita K, Yoshioka Y, Pan H. Biochemical and hematologic effects of polyvinylpyrrolidonewrapped fullerene C60 after oral administration. Pharmazie 2013; 68(1):54-7.

15. Folkmann JK, Risom L, Jacobsen NR, Wallin H. Oxidatively damaged DNA in rats exposed by oral gavage to C60 fullerenes and single-walled carbon n anotubes. Environ Health Perspec 2009; 117:703–708.

16. Gharbi N, Pressac M, Hadchouel M. (2005) [60] Fullerene is a powerful antioxidant in vivo with no acute or subacute toxicity. Nano Lett 2005; 5:2578–85.

17. Zogovic NS, Nikolic NS, Vranjes-Djuric SD et al. Opposite effects on n anocrystalline fullerene (C60) on tumor cell growth in vitro and in vivo and a possible role of immunosuppression in the cancerpromoting activity of C60. Biomaterials 2009; 30:6940–6946.

18. Chien CT, Lee PH, Chen CF, Ma MC. De novo demonstration and co-localization of free-radical production and apoptosis formation in rat kidney subjected to ischemia/reperfusion. J Am Soc Nephrol 2001; 12:973–982

19. Ueng TH, Kang JJ, Wang HW. Suppression of microsomal cytochrome P450-dependent monooxygen ases and mitochondrial oxidative phosphorylation by fullerenol, a polyhydroxylated fullerene C60. Toxicol Lett 1997; 93:29–37

20. Milic VD, Stankov K, Injac R, Djordjevic A et al. Activity of antioxidative enzymes in erythrocytes after a single dose administration of doxorubicin in rats pretreated with fullerenol C60(OH)24. Toxicol Mech Methods 2009; 19:24–28.

21. Injac R, Perse M, Cerne M, Potocnik N et al. Protective effects of fullerenol C60(OH)24 against doxorubicin-induced cardiotoxicity and hepatotoxicity in rats with colorectal cancer. Biomaterials 2009; 30:1184–1196.

22. Sumner SC, Snyder RW, Wingard C. Distribution and biomarkers of carbon-14-labeled fullerene C60 ([14 C(U)]C60 ) in female rats and mice for up to 30 days after intravenous exposure. J Appl Toxicol 2015. Doi: 10.1002/jat.3110.

23. Snyder RW, Fennell TR, Wingard CJ. Distribution and biomarker of carbon-14 labeled fullerene C60 ([14 C(U)]C60 ) in pregn ant and lactating rats and their offspring after matern al intravenous exposure. J Appl Toxicol 2015 doi: 10.1002/jat.3177.

24. Nikolic´ N, Vranjes-Ethuric´ S, Jankovic´. Preparation and biodistribution of radiolabeled fullerene C60 n anocrystals. Nanotechnology 2009; 20:385102.

25. Li Z, Pan LL, Zhang FL. Preparation and characterization of fullerene (C60) amino acid n anoparticles for liver cancer cell treatment. J Nanosci Nanotechnol 2014 Jun;14(6):4513-8.

26. Shamenkov D.A., Petrov V.E., Alyautdin R.N. Effects of apolipoproteins on dalargin transport across the blood-brain barrier. Bulletin of Experimental Biology and Medicine 2006; 142: 703-706.

27. Аляутдин Р.Н., Романов Б.К., Лепахин В.К. и соавт. Связанный с альбуминовыми наночастицами паклитаксел – первые шаги нанотехнологий в клиническую практику. Безопасность и риск фармакотерапии 2014; 2: 10-17.